Жидкие биопсии и выявление мутации гена EGFR

Определение мутаций гена EGFR при немелколеточном раке легкого (НМРЛ) стало стандартом современной онкологии, поскольку назначение ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) 1-го и последующих поколений позволило существенно увеличить срок жизни ранее малокурабельных пациентов. Применение жидкой биопсии позволяет разрешить некоторые проблемы с выявлением такой мутации.

Ирина Анатольевна Демидова, к.м.н., заведующая лабораторией молекулярной биологии ГБУЗ «МГОБ No62 ДЗМ»

 

 

 

 

 

Получение достаточного количества опухолевой ткани для проведения адекватного тестирования и выявления мутации до сих пор остается серьезным препятствием для назначения современного лечения. От 20 до 30% нуждающихся пациентов не могут подвергнуться инвазивным методам диагностики по причине сложного расположения опухоли или своего тяжелого состояния [1].

Привлекательный источник опухолевого материала в такой ситуации — циркулирующие в крови пациента опухолевые клетки (CTC — circulating tumor cells, ЦОК) и опухолевая ДНК (cfDNA — circulating free DNA, цоДНК). Их источник — опухолевые очаги, как первичные, так и метастатические (рис. 1). Выделение как ЦОК, так и цоДНК из большого числа биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) получило название «жидкая биопсия».

Новые открытия в геномике злокачественных опухолей не только существенно обогатили наше понимание этиологии и патогенеза онкологических заболеваний, но и значительно изменили алгоритмы диагностики, что, в свою очередь, во многом изменило традиционную лечебную тактику и привело к ранее невозможным успехам в лечении ряда заболеваний.

Срок их жизни в циркуляции короток (как правило, не превышает суток), однако при соблюдении необходимых условий, о которых будет упомянуто ниже, вполне достаточен для получения адекватного количества опухолевого материала. Как ЦОК, так и цоДНК имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от задач исследователя (табл. 1).

Учитывая крайне малое количество ЦОК и существенную дороговизну их получения, наиболее приемлемым для практического использования считается цоДНК.

Циркулирующая опухолевая ДНК

Феномен внеклеточной циркулирующей ДНК (цДНК) впервые описан в 1948 г. Прак- тически у любого здорового человека возможно выявить цДНК, причем ее количество существенно увеличивается после физической нагрузки, а также превышает обычные значения при беременности у пациентов с опухолевыми заболеваниями [3]. Как правило, цДНК представляет собой короткие фрагменты — продукты как здоровых тканей, так и опухолевых клеток [4]. Интересно, что опухоль, содержащая около 50 млн клеток, выделяет достаточное для определения в крови количество цоДНК, в то время как позитронно-эмиссионная и компьютерная томография (ПЭТ- КТ) способна увидеть опухоль размером не более 7–10 мм, то есть содержащую около 1 млрд злокачественных клеток [1].

Безусловно, количество цоДНК напрямую зависит от опухолевой массы, проведенной те- рапии, оперативного вмешательства и так далее, причем ее количество может колебаться от 0,01 до 90% всей цДНК. Нам пока не до конца известны все закономерности колебаний количества цоДНК [5].

Однако совершенствование новых методов транспортировки, выделения цоДНК из плаз- мы, появление новых высокочувствительных методик детекции мутаций позволили говорить о возможности внедрения исследований цоДНК в клиническую практику.

Возможности использования цоДНК при НМРЛ

Использование цоДНК при НМРЛ имеет свои точки применения, достоинства и определенные сложности. Не стоит забывать, что биопсийный материал по-прежнему признается «золотым стандартом» диагностики, однако, как уже говорилось выше, получение его требует серьезных дорогостоящих манипуляций, иногда опасных для пациентов. Кроме того, современная обработка биопсийного материала ведет к выраженному повреждению ДНК, что может привести к невозможности выполнения анализа или появлению артифициальных мутаций [6]. Взятие образца из одного участка опухоли далеко не всегда отражает весь спектр генетических нарушений в связи с феноменом внутриопухолевой гетерогенности [7].

Наконец, повторные биопсии могут быть выполнены лишь у части пациентов при развитии прогрессирования и не могут быть часто использованы для контроля за течением болезни.

«Жидкие биопсии» лишены этих недостатков. ЦоДНК, выделенная из крови пациента с НМРЛ, не только позволяет провести первичное генетическое тестирование, но и отражает полный «генетический портрет» опухоли, так как несет информацию о структуре всех очагов поражения.

Забор крови для получения цоДНК дешев и безопасен для пациента и может проводиться с определенной периодичностью для исследования появления возможных мутаций резистентности еще до клинических признаков прогрессирования. Более того, в ряде случаев выявление мутаций резистентности (а именно Т790М) в первичных образцах может помочь доктору правильно выбрать тактику лечения с самого начала заболевания [8].

Проведенные в последние годы исследования подтверждают высокую конкордантность между мутационным статусом гена EGFR в парных образцах опухоли и цоДНК. Так, в исследовании Douillard et al. показана конкордантность мутационного статуса между опухолевыми образцами и цоДНК 94,3% с чувствительностью 65,7% и специфичностью 99,8% [9]. Похожие результаты получе- ны Mok et al. В их исследовании конкордантность между мутационным статусом гена EGFR в парных образцах опухоли и цоДНК составила 88%, чувствительность — 75%, специфичность — 96% [10]. Эти данные подтверждают возможность использования цоДНК в клинической практике.

Наиболее интересны результаты исследований, использующих цоДНК для изначального определения резистентности опухоли к терапии ИТК 1-го поколения с помощью выявления первичной мутации Т790М. Так, в рабо- те Wang et al. показана худшая выживаемость носителей мутации резистентности, получавших ИТК 1-го поколения, в сравнении с пациентами без Т790М, причем выживаемость пациентов ухудшалась с увеличением процента T790M+-клеток (рис. 2) [11].

Появление ИТК нового поколения, позволяющих эффективно бороться с мутациями резистентности, привело к необходимости периодического контроля за лечением, позволяющим как можно раньше назначить новый препарат и отслеживать его эффективность.

Именно исследования цоДНК показали свою значимость для этой цели, определяя динамику мутации резистентности раньше, чем стандартные методы исследования выявляли прогрессию заболевания (рис. 3).

Особенности работы с цоДНК

Конечно, успех работы с цоДНК связан с соблюдением определенных условий. Достаточно важное условие — правильный отбор пациентов. Пациенты с небольшой опухолевой массой, операбельные или имеющие единичные небольшие метастатические очаги, как правило, не несут достаточного для детекции количества опухолевой ДНК в циркуляции и чаще всего не могут быть достоверно обследованы с помощью поиска мутаций в биологических жидкостях в рутинных условиях. Для работы с такими пациентами требуются особо чувствительные методы детекции, возможно, большее значение имеет определение ЦОК. В обычной практике для них все же предпочтительнее биопсия [13, 14].

Следующее важное условие — правильная работа с кровью: она должна быть либо в течение часа доставлена в лабораторию, либо взята в пробирки со специальным консервантом, сохраняющим целостность цоДНК в течение длительного времени, либо из нее немедленно должна быть выделена плазма и правильно заморожена. Разрушение цоДНК происходит практически поминутно [15]. Кроме того, все больше исследователей соглашаются с необходимостью забора не менее 10 мл крови для обеспечения гарантированного получения достаточного количества цоДНК.

Далее уже в лаборатории цоДНК должна быть выделена наиболее оптимальным способом и исследована наиболее чувствительным методом, доступным исследователям. Ниже при- ведены наиболее распространенные методы с указанием их чувствительности (табл. 2).

К сожалению, далеко не все методы доступны в нашей стране в связи с их дороговизной или отсутствием регистрации. Однако наиболее зарекомендовавшие себя методы, включающие несколько видов ARMS-PCR и цифровой (digital) полимеразной цепной реакции (ПЦР), вполне доступны и используются лабораториями, входящими в программу Российского общества клинической онкологии «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации». Таким образом, исследования цоДНК при НМРЛ могут быть внедрены для рутинной практики в ближайшее время и в нашей стране, после прохождения необходимых процедур стандартизации и валидации методик.

Список литературы находится в редакции.

Автор публикации

не в сети 19 часов

Редакция

Комментарии: 0Публикации: 608Регистрация: 11-07-2017

Добавить комментарий

Авторизация
*
*
Регистрация
*
*
*
Генерация пароля